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Definición de la prueba de hidrólisis de gelatina
La prueba de hidrólisis de gelatina es una prueba bioquímica que se realiza como prueba presuntiva para la identificación de Staphylococcus , Enterococcus y otros bacilos grampositivos.
- La prueba de hidrólisis de gelatina también se denomina prueba de licuefacción de gelatina, ya que implica la licuefacción de gelatina en presencia de la enzima gelatinasa.
- La gelatinasa es una enzima importante en varios organismos patógenos, ya que se produce extracelularmente, lo que hidroliza la gelatina que se deriva del colágeno que se encuentra en los tejidos conectivos de los vertebrados.
- Estas enzimas pueden funcionar como un factor de virulencia que disuelve los tejidos conectivos de las células del huésped, lo que ayuda en las infecciones invasivas.
- La gelatina es una proteína que se licua en presencia de la enzima gelatinasa cuando la enzima descompone la estructura compleja de la gelatina en aminoácidos monoméricos.
- La prueba se ha utilizado durante años como una prueba presuntiva para la identificación de una amplia variedad de organismos como Serratia , Pseudomonas , Flavobacterium y Clostridium.
Objetivos de la prueba de hidrólisis de gelatina
- Probar la capacidad de un organismo para licuar la gelatina mediante la producción de la enzima gelatinasa.
- Diferenciar organismos en diferentes grupos en función de su capacidad para hidrolizar gelatina.
Principio de la prueba de hidrólisis de gelatina
- La gelatina es una proteína derivada del tejido conectivo animal, el colágeno, que forma una estructura sólida a temperaturas más bajas.
- La proteína es metabolizada o degradada por un grupo de enzimas llamadas gelatinasa.
- Las gelatinasas son enzimas proteolíticas que hidrolizan la gelatina en polipéptidos y aminoácidos individuales.
- La degradación de la gelatina, como la mayoría de las proteínas, se produce en dos pasos; el primer paso implica la degradación de la gelatina en polipéptidos, seguida de la conversión de polipéptidos en aminoácidos.
- La gelatinasa es importante en la mayoría de las bacterias, ya que la gelatina es un polímero grande y, por lo tanto, no puede transportarse al interior de la célula.
- La enzima, por lo tanto, descompone la gelatina en unidades más pequeñas, que pueden ser transportadas a la célula y utilizadas por las bacterias.
- En la prueba de hidrólisis se utilizan medios con gelatina y su hidrólisis se observa por licuefacción de los medios o por inundación con cloruro de mercurio.
- El cloruro de mercurio agregado al medio precipita la gelatina mientras que las áreas donde se hidroliza la gelatina aparecen claras.
Microorganismos probados
- Bacilos gramnegativos que requieren gelatina para su identificación, especialmente para la separación de Pseudomonas fluorescentes : Pseudomonas putida (negativo) de Pseudomonas fluorescens (positivo).
- Bacilos grampositivos según sea necesario para la identificación a nivel de especie.
Medios, reactivos y suministros utilizados
Medios utilizados
- Los medios de gelatina nutritiva se utilizan para la demostración de la hidrólisis de la gelatina, ya sea mediante la adición de cloruro de mercurio o mediante la licuefacción de la gelatina.
- La composición de los medios de gelatina nutritiva se da a continuación:
SN | Ingredientes | Gramo / litro |
1. | Triptosa | 20,0 |
2. | Extracto de carne | 3,0 |
3. | Gelatina | 10.0 |
4. | Sulfato de manganeso | 0,01 |
5. | Así que eso | 15.0 |
PH final a 25 ° C: 6,8 ± 0,2 |
Reactivo utilizado
- Cloruro de mercurio (HgCl 2 )
Suministros utilizados
- Aguja de inoculación
- Incubadora a 37 ° C
- Pipetas
Procedimiento de prueba de hidrólisis de gelatina
A. Preparación de los medios
- Aproximadamente 128 gramos del medio deshidratado se toman en un vaso de precipitados con 1000 mililitros de agua destilada tibia (50 ° C).
- Luego, la solución se calienta con agitación para llevarla a ebullición con el fin de disolver el medio por completo.
- El medio se distribuye en varios tubos de ensayo y se esteriliza en autoclave a una presión de 15 libras (121 ° C) durante 15 minutos. En el caso del método de la placa de agar, el medio se esteriliza en autoclave en el vaso de precipitados.
- El medio entubado se enfría a 45-50 ° C en posición vertical.
B. Hidrólisis de gelatina
La hidrólisis de gelatina se puede observar ya sea mediante el método de punción de gelatina nutritiva o inundando las placas de agar con cloruro de mercurio.
1. Método de puñalada
- El medio de gelatina en el tubo se inocula con 4-5 gotas de un medio de caldo de 24 horas.
- Los tubos inoculados se incuban a 37 ° C en aire durante 24-48 horas. Si los organismos crecen bien a 25 ° C, la incubación debe realizarse a 25 ° C.
- Después de la primera incubación, los tubos deben colocarse a 4 ° C durante otras 24 horas.
2. Método del plato
- Se toma un inóculo pesado de un cultivo de 18-24 horas con un asa de inoculación y se inocula en un medio de gelatina nutritiva.
- A continuación, las placas se incuban a 37 ° C durante 24-48 horas.
Interpretación de los resultados de la prueba de hidrólisis de gelatina
Prueba de tubo
- La licuefacción parcial o total de la gelatina en los tubos de ensayo indica un resultado positivo.
- La solidificación completa de la gelatina a 4 ° C representa un resultado negativo.
Método de placa
- Una zona clara alrededor de las colonias después de la adición de cloruro de mercurio (HgCl 2 ) indica un resultado positivo en placas de agar.
- La ausencia de zonas claras alrededor de las colonias después de la adición de cloruro de mercurio es representativa de un resultado negativo.
Organismos de control
- Resultado positivo: Bacillus subtilis.
- Resultado negativo: Escherichia coli.
Usos de la prueba de hidrólisis de gelatina
- La prueba de hidrólisis de gelatina se usa para probar la capacidad de un organismo para producir gelatinasas.
- La prueba de hidrólisis de gelatina ayuda en la identificación de S erratia , Pseudomonas , Flavobacterium y Clostridium .
- La prueba distingue el Staphylococcus aureus patógeno positivo a gelatinasa del Staphylococcus epidermidis no patógeno gelatinasa negativo .
- La prueba se puede utilizar para diferenciar géneros de bacterias productoras de gelatinasa como Serratia y Proteus de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae .
Limitaciones de la prueba de hidrólisis de gelatina
- La gelatinasa actúa principalmente en la superficie del medio del tubo. Agitar el tubo mientras está caliente puede resultar en un resultado falso negativo.
- La gelatina puede variar en su capacidad gelificante; por lo tanto, se debe inocular un control no inoculado con la prueba. El control debe refrigerarse junto con la prueba, antes de la lectura.
- Pueden producirse resultados falsos positivos con el método del tubo en algunos medios o solución salina en incubación prolongada, es decir, más de 4 horas. Esto se puede detectar en el tubo de control sin inocular.
- El método de la placa no se recomienda para la determinación de la licuefacción de gelatina por especies exigentes y anaerobios obligados.
- Si los tubos se incuban a temperaturas superiores a 20 ° C, los tubos deben enfriarse por debajo de 20 ° C antes de que se puedan llevar a cabo las reacciones.
Dr. Martin Passen, a dedicated nutrition educator with a master’s in nutrition education and nearing completion of a clinical nutrition and dietetics master’s. Passionate about sharing valuable information effectively.