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Definición de ultracentrífuga
La ultracentrífuga es una centrífuga sofisticada y avanzada que funciona a una velocidad extremadamente alta y separa moléculas más pequeñas que no se pueden separar de las centrífugas tradicionales.
- La velocidad de los rotores en la ultracentrífuga puede oscilar entre 60.000 rpm y 150.000 rpm.
- Las ultracentrífugas se operan principalmente en laboratorios más facilitados para realizar operaciones más avanzadas.
- Estos son de mayor tamaño y pueden operar muestras en lotes o como un sistema de flujo continuo.
- La mayoría de las ultracentrífugas se refrigeran para controlar el calor que podría generarse debido a la velocidad excesiva.
Principio de ultracentrífuga
- La ultracentrífuga funciona según el mismo principio que todas las demás centrífugas.
- El funcionamiento de una ultracentrífuga se basa en el principio de sedimentación, que establece que las partículas más densas se depositan más rápido en comparación con las partículas menos densas bajo la gravedad.
- Sin embargo, la sedimentación de partículas por gravedad llevaría más tiempo, y es por eso que se aplica una fuerza adicional para ayudar al proceso de sedimentación.
- En una ultracentrífuga, la muestra se gira alrededor de un eje, lo que genera una fuerza perpendicular, denominada fuerza centrífuga, que actúa sobre diferentes partículas de la muestra.
- Las moléculas más grandes se mueven más rápido, mientras que las moléculas más pequeñas se mueven más lentamente.
- Al mismo tiempo, las moléculas más densas se mueven hacia la periferia de los tubos, mientras que las moléculas menos densas giran hacia el centro del tubo.
- Una vez que se completa el proceso, las partículas más grandes y densas se depositan, formando gránulos en el fondo del tubo. En comparación, las partículas más pequeñas y menos densas permanecen suspendidas en el sobrenadante o flotan en la superficie.
Tipos de ultracentrífuga
Según la aplicación y el propósito, las ultracentrífugas son de dos tipos;
1. Ultracentrífuga analítica (AUC)
- Las centrífugas analíticas, como su nombre indica, son las ultracentrífugas que se utilizan para el análisis de diversas partículas presentes en la muestra.
- La ultracentrifugación analítica (AUC) es un método versátil y robusto para el análisis cuantitativo de macromoléculas en solución.
- Estas ultracentrífugas tienen sistemas de detección para monitorear el giro y la posición de las partículas en tiempo real para determinar el coeficiente de sedimentación que ayuda en el análisis de partículas en función de su forma, tamaño y masas.
- La ultracentrifugación analítica para la determinación de la masa molecular relativa de una macromolécula se puede realizar mediante un enfoque de velocidad de sedimentación o una metodología de equilibrio de sedimentación.
- Las propiedades hidrodinámicas de las macromoléculas se describen por sus coeficientes de sedimentación. Los coeficientes se pueden determinar a partir de la velocidad a la que se mueve un límite de concentración de las biomoléculas particulares en el campo gravitacional.
- El coeficiente de sedimentación se puede utilizar para caracterizar cambios en el tamaño y la forma de las macromoléculas con condiciones experimentales cambiantes.
- Hay tres sistemas ópticos disponibles para la ultracentrífuga analítica (absorbancia, interferencia y fluorescencia) que permiten una observación precisa y selectiva de la sedimentación en tiempo real.
- Uno de los ejemplos de los sistemas de detección utilizados en la ultracentrífuga es el sistema óptico Schlieren que observa las partículas en la centrífuga en tiempo real para determinar su posición y movimiento.
- En función de la posición, se pueden determinar los coeficientes de sedimentación, lo que permite determinar las propiedades de diferentes moléculas.
- La ultracentrífuga analítica se usa más comúnmente para la determinación de propiedades de biomoléculas como proteínas y ácidos nucleicos.
2. Ultracentrífuga preparativa
- Las ultracentrífugas preparativas son las centrífugas que se utilizan principalmente para el aislamiento y separación de partículas en una muestra mediante el proceso de centrifugación.
- En una corrida preparativa de una ultracentrífuga, el contenido de los tubos se analiza después del período de centrifugación, a diferencia de la centrífuga analítica donde el análisis se realiza durante el proceso de centrifugación.
- Las ultracentrífugas preparativas se pueden operar para diferentes tipos de procesos de centrifugación como centrifugación en gradiente de densidad, centrifugación diferencial y centrifugación isopícnica.
- Las partículas de una muestra se separan en función de su densidad o de su tamaño.
- En la centrifugación en gradiente de densidad y en la centrifugación isopícnica, las partículas de una muestra se separan en función de su densidad. Las diferentes partículas presentes en una muestra se aíslan en forma de bandas en distintos niveles donde la densidad de la partícula es igual a la densidad del medio.
- En la centrifugación diferencial, sin embargo, las partículas se separan aplicando diferentes velocidades de los rotores. Las partículas más grandes se depositan a velocidades más bajas, mientras que las partículas más pequeñas requieren una velocidad más alta para la separación.
- Debido a que las partículas se separan sobre la base de la densidad y el tamaño, se pueden utilizar ultracentrífugas preparativas para la determinación de la densidad y el tamaño de diferentes partículas.
Instrumentación / Partes de ultracentrífuga
- Las ultracentrífugas se proporcionan con una variedad de piezas y componentes que realizan diferentes funciones.
- Los rotores son una parte esencial de cualquier ultracentrífuga. Las ultracentrífugas utilizan los tres tipos de rotores, a saber, rotores verticales, rotores de cubeta oscilante y rotores de ángulo fijo.
- El rotor de cubeta oscilante es el rotor más utilizado en la ultracentrífuga porque produce la mayor concentración de partículas. Esto se debe a que la dirección de la fuerza centrífuga en los rotores verticales se alinea con la posición de los tubos.
- El accionamiento es la unidad de potencia que hace girar el rotor que contiene células o tubos que contienen la solución de moléculas o suspensión de partículas.
- Además del accionamiento eléctrico y los rotores intercambiables, incluye rotores analíticos con capacidad para cuatro celdas, dispositivos de temperatura con rango y control de 0 ° a 40 °, celdas con espesores que cubren un factor de 10 en la sensibilidad y ventanas de cuarzo en forma de cuña que permiten varias celdas. para ser utilizado simultáneamente.
- El sistema de temperatura permite el control de la temperatura en el sistema ya que la producción de calor es común durante el funcionamiento de la ultracentrífuga a altas velocidades.
- La ultracentrífuga analítica también tiene un comparador bidimensional con una calculadora de escritorio de impresión, sistemas ópticos de interferencia y absorción. Los sistemas ópticos son necesarios para el análisis de moléculas en tiempo real.
- Además, un dispositivo de formación de gradientes, refractómetros manuales y un espectrofotómetro de registro con celda de flujo y recolector de fracciones también podrían estar presentes en una ultracentrífuga preparativa.
Procedimiento / Pasos de la ultracentrífuga
El proceso de operar una ultracentrífuga puede diferir dependiendo de si es una ultracentrífuga analítica o una ultracentrífuga preparativa. En general, los siguientes son los pasos a seguir al realizar la ultracentrifugación analítica:
- Se toman muestras pequeñas (20-120 mm 3 ) en celdas analíticas para colocarlas dentro de la ultracentrífuga.
- A continuación, se hace funcionar la ultracentrífuga de modo que la fuerza centrífuga provoque una migración de las biomoléculas distribuidas aleatoriamente a través del disolvente radialmente hacia fuera desde el centro de rotación.
- La distancia de las moléculas al centro se determina mediante el sistema óptico de Schlieren.
- Se dibuja un gráfico a partir de la concentración de soluto frente a la distancia radial al cuadrado desde el centro de rotación, en función de la cual se determina la masa molecular.
El siguiente es el procedimiento para el funcionamiento de una ultracentrífuga preparativa:
1. Centrifugación en gradiente de densidad
- En la ultracentrífuga preparativa con gradiente de densidad, se debe preparar un gradiente de densidad. Para ello, se aplica una capa de sacarosa menos concentrada sobre una capa de sacarosa más concentrada que crea un gradiente de densidad de sacarosa. Algunas ultracentrífugas vienen con dispositivos de formación de gradientes que pueden hacer el gradiente por sí mismos.
- Luego se coloca la muestra en el tubo de centrífuga sobre el gradiente, y luego se colocan los tubos en las rejillas de los rotores de las ultracentrífugas.
- La temperatura y el tiempo se establecen en la ultracentrífuga antes de que se inicie el proceso.
- Se cierra la tapa y se inicia el proceso.
- Las partículas viajan a través del gradiente hasta que alcanzan un punto en el que su densidad coincide con la densidad del medio circundante.
- Las fracciones se retiran y separan, obteniendo las partículas como unidades aisladas.
2. Centrifugación diferencial
- En la centrifugación diferencial, la muestra se homogeneiza en el medio que contiene el tampón.
- Luego, la muestra se coloca en el tubo de centrífuga, que se opera a una fuerza centrífuga particular durante un tiempo específico a una temperatura particular.
- Al final de esta operación, se formará una pastilla en el fondo del tubo, que se separará del sobrenadante.
- El sobrenadante se agrega a un nuevo tubo de centrífuga donde se centrifuga a otra velocidad durante un tiempo y una temperatura particulares.
- De nuevo, el sobrenadante se separa de los gránulos formados.
- Estos pasos se continúan hasta que todas las partículas se separan entre sí.
- Luego, las partículas se pueden identificar probando indicadores que sean exclusivos de las partículas específicas.
Usos de la ultracentrífuga
- Las ultracentrífugas preparativas se utilizan en biología para una fracción de sedimentación de orgánulos celulares como mitocondrias, ribosomas e incluso virus.
- La centrifugación en gradiente de densidad utiliza gradientes de sal de cesio para la separación de ácidos nucleicos como el ADN y el ARN.
- La ultracentrífuga analítica permite la detección y caracterización de cambios conformacionales macromoleculares debido a cambios de pH, temperatura y otros factores ambientales.
- El AUC también permite la determinación de estequiometrías de varias macromoléculas como masas moleculares, tamaño, etc.
- Las ultracentrífugas analíticas también ayudan a diferenciar entre el montaje y el desmontaje de varios complejos biomoleculares.
- Las ultracentrífugas también se utilizan en la determinación de densidades de diversas macromoléculas.
- Además, también permite la purificación de diversos extractos biológicos crudos.
Precauciones
Las ultracentrífugas son dispositivos susceptibles, por lo que deben utilizarse tomando todas las precauciones necesarias. Algunas de estas precauciones son:
- Mientras se ejecuta una ultracentrífuga, siempre se debe seguir el manual del fabricante.
- Los rotores deben manipularse con cuidado y deben observarse de forma rutinaria para detectar signos de corrosión y grietas.
- Al agregar los tubos a los rotores, el volumen de la muestra en los tubos debe ser igual.
- La cantidad de tubos añadidos a una ultracentrífuga siempre debe estar equilibrada. Si no hay suficiente carga de muestra disponible, se debe agregar agua destilada a los tubos para ajustar.
- La velocidad del rotor no debe exceder el valor asignado.
- La tapa de la cámara debe permanecer siempre cerrada durante la operación.
- Para evitar daños en los rotores, se debe seguir la guía del fabricante sobre cuidado y manejo de rotores.
Dr. Martin Passen, a dedicated nutrition educator with a master’s in nutrition education and nearing completion of a clinical nutrition and dietetics master’s. Passionate about sharing valuable information effectively.