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Principio de PCR
La secuencia diana de ácido nucleico se desnaturaliza en hebras simples, se agregan cebadores específicos para cada secuencia de hebra diana y la ADN polimerasa cataliza la adición de desoxinucleótidos para extender y producir nuevas hebras complementarias a cada una de las hebras de la secuencia diana (ciclo 1). En el ciclo 2, ambos productos bicatenarios del ciclo 1 se desnaturalizan y, posteriormente, sirven como objetivos para una mayor hibridación y extensión de cebadores por la ADN polimerasa. Después de 25 a 30 ciclos, se pueden producir al menos 107 copias del ADN diana mediante este ciclo térmico.
Requisitos para PCR
- Una reacción de PCR contiene el ADN de doble hebra diana, dos cebadores que se hibridan con secuencias flanqueantes en las hebras opuestas de la diana, los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfatos y una ADN polimerasa junto con tampón, cofactores de enzima y agua.
- Dado que la reacción se calienta periódicamente a alta temperatura, la PCR depende del uso de una ADN polimerasa termoestable.
- Muchas de estas enzimas termoestables de bacterias termófilas (bacterias que viven en entornos de alta temperatura) están ahora disponibles comercialmente.
- La primera y más utilizada es la polimerasa Taq de la bacteria termófila Thermus aquaticus .
Pasos involucrados
A. Extracción y desnaturalización del ácido nucleico diana
- Para la PCR, primero se extrae (libera) ácido nucleico del organismo o de una muestra clínica que potencialmente contenga el organismo objetivo mediante métodos térmicos, químicos o enzimáticos.
- Una vez extraído, el ácido nucleico diana se agrega a la mezcla de reacción que contiene todos los componentes necesarios para la PCR (cebadores, nucleótidos, iones covalentes, tampón y enzima) y se coloca en un termociclador para someterse a amplificación.
B. Pasos en la amplificación
- La PCR convencional implica de 25 a 50 ciclos repetitivos, y cada ciclo comprende tres reacciones secuenciales:
- Desnaturalización del ácido nucleico diana
- Hibridación del cebador con la extensión del ácido nucleico diana monocatenario del dúplex diana del cebador.
- Extensión del dúplex cebador-objetivo.
Desnaturalización
- La mezcla de reacción se calienta a 95 ° C durante un corto período de tiempo (alrededor de 15 a 30 segundos) para desnaturalizar el ADN diana en hebras simples que pueden actuar como plantillas para la síntesis de ADN.
Recocido de imprimación
- La mezcla se enfría rápidamente a una temperatura definida que permite que los dos cebadores se unan a las secuencias en cada una de las dos hebras que flanquean el ADN diana.
- Los cebadores son secuencias cortas, monocatenarias de ácido nucleico (es decir, oligonucleótidos normalmente de 20 a 30 nucleótidos de longitud) seleccionados para hibridar (aparearse) específicamente con una diana de ácido nucleico particular, esencialmente funcionando como sondas.
- Esta temperatura de hibridación se calcula cuidadosamente para asegurar que los cebadores se unan solo a las secuencias de ADN deseadas (generalmente alrededor de 55 ° C).
- Un cebador se une a cada hebra. Las dos hebras parentales no se reasocian entre sí porque los cebadores tienen un gran exceso sobre el ADN parental.
Extensión
- La temperatura de la mezcla se eleva a 72 ° C (normalmente) y se mantiene a esta temperatura durante un período de tiempo preestablecido para permitir que la ADN polimerasa alargue cada cebador copiando las plantillas monocatenarias.
- El recocido de cebadores con secuencias diana proporciona el formato de plantilla necesario que permite que la ADN polimerasa agregue nucleótidos al extremo 3 ‘(extremo) de cada cebador y extienda la secuencia complementaria a la plantilla diana.
- La polimerasa Taq es la enzima comúnmente utilizada para la extensión del cebador, que se produce a 72 ° C. Esta enzima se utiliza debido a su capacidad para funcionar eficientemente a temperaturas elevadas y para resistir la temperatura desnaturalizante de 94 ° C a través de varios ciclos.
- La capacidad de permitir que se produzca la hibridación y extensión del cebador a temperaturas elevadas sin detrimento de la polimerasa aumenta la rigurosidad de la reacción, disminuyendo así la posibilidad de amplificación de ácido nucleico no diana (es decir, amplificación inespecífica).
Se repiten los tres pasos del ciclo de PCR.
- Así, en el segundo ciclo, las cuatro hebras se desnaturalizan, se unen a los cebadores y se extienden. No es necesario añadir otros reactivos. Los tres pasos se repiten durante un tercer ciclo y así sucesivamente durante un conjunto de ciclos adicionales.
- En el tercer ciclo, algunos de los productos de la PCR representan la secuencia de ADN solo entre los dos sitios del cebador y la secuencia no se extiende más allá de estos sitios.
- A medida que se llevan a cabo más y más ciclos de reacción, el ADN bicatenario se sintetiza más en número. Después de 20 ciclos, el ADN original se ha amplificado un millón de veces y esto aumenta a mil millones de veces (1000) millones después de 30 ciclos.
C. Análisis de producto
- La electroforesis en gel del producto amplificado se emplea comúnmente después de la amplificación.
- El ADN amplificado se migra electroforéticamente de acuerdo con su tamaño molecular realizando electroforesis en gel de agarosa.
- El ADN amplificado forma bandas claras que se pueden visualizar bajo luz ultravioleta (UV).
Ventajas de la PCR
- La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es una técnica extremadamente simple pero inmensamente poderosa.
- Permite una enorme amplificación de cualquier secuencia específica de ADN siempre que se conozcan secuencias cortas a ambos lados.
- Permita un diagnóstico e identificación más rápidos mientras mejora la sensibilidad y mantiene la especificidad.
Aplicaciones de la PCR
La PCR ya tiene aplicaciones muy extendidas y se están ideando nuevos usos con regularidad.
- La PCR puede amplificar una sola molécula de ADN a partir de una mezcla compleja, evitando en gran medida la necesidad de utilizar la clonación de ADN para preparar esa molécula. Las variantes de la técnica pueden amplificar de manera similar una única molécula de ARN específica a partir de una mezcla compleja.
- La secuenciación del ADN se ha simplificado enormemente mediante la PCR, y esta aplicación ahora es común.
- Mediante el uso de cebadores adecuados, es posible utilizar la PCR para crear mutaciones puntuales, deleciones e inserciones de ADN diana, lo que facilita enormemente el análisis de la expresión y función de los genes.
- La PCR es sumamente sensible y puede amplificar cantidades extremadamente pequeñas de ADN. Por lo tanto, utilizando cebadores apropiados, se pueden detectar cantidades muy pequeñas de bacterias y virus específicos en los tejidos, lo que hace que la PCR sea invaluable para el diagnóstico médico.
- La PCR es ahora invaluable para caracterizar muestras de ADN de importancia médica. Por ejemplo, en la detección de enfermedades genéticas humanas, está reemplazando rápidamente el uso de RFLP.
- Debido a su extrema sensibilidad, la PCR es ahora fundamentalmente importante para la medicina forense. Incluso es posible utilizar la PCR para amplificar el ADN de un solo cabello humano o una gota microscópica de sangre dejada en la escena de un crimen para permitir una caracterización detallada.
Dr. Martin Passen, a dedicated nutrition educator with a master’s in nutrition education and nearing completion of a clinical nutrition and dietetics master’s. Passionate about sharing valuable information effectively.