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¿Qué es la prueba de solubilidad en bilis?
La prueba de solubilidad biliar es una prueba bioquímica que se utiliza para diferenciar y confirmar Streptococcus pneumoniae de otros estreptococos alfa-hemolíticos.
- La prueba de solubilidad en bilis se ha utilizado como una prueba esencial para la diferenciación de S. pneumoniae, ya que permite distinguir entre las dos especies de S. pneumoniae y Streptococcus pseudopneumoniae , lo cual es una tarea desafiante.
- La prueba se basa en la lisis de las células bacterianas en presencia de determinadas sales biliares como el desoxicolato de sodio en determinadas condiciones. Los organismos que lisan se consideran positivos, mientras que los que no lo hacen se consideran negativos.
- El mecanismo de trabajo exacto de la prueba aún no se comprende claramente, pero se ha planteado la hipótesis de que la lisis se produce por inducción de enzimas autolíticas.
- En general, se considera que la prueba de solubilidad en la bilis es una prueba precisa para diferenciar S. pneumoniae de otros estreptococos del grupo mitis, incluido S. pseudopneumoniae .
- Sin embargo, los resultados de las pruebas del método son difíciles de interpretar, sobre todo porque se basa en una evaluación humana subjetiva.
Objetivos de la prueba de solubilidad en bilis
- Identificar y diferenciar S. pneumoniae de otros estreptococos alfa-hemolíticos.
- Detectar la capacidad de un organismo de someterse a lisis en presencia de sales biliares.
Principio de la prueba de solubilidad en bilis
- La prueba de solubilidad en la bilis se utiliza para identificar y distinguir S. pneumoniae de Streptococcus spp. Alfa-hemolíticos .
- La prueba se puede realizar usando una suspensión celular en un portaobjetos o en un tubo o agregando el reactivo directamente a la colonia.
- El principio de solubilidad de la bilis prueba la lisis de las células neumocócicas cuando se aplica desoxicolato de sodio (sales biliares) a la colonia en condiciones específicas de tiempo y temperatura, pero otros estreptococos no se lisan.
- El neumococo tiene una enzima autolítica intracelular, una amidasa, que hace que el organismo experimente una autólisis rápida cuando se cultiva en un medio artificial.
- Las sales biliares alteran la tensión superficial del medio y provocan un reordenamiento de la membrana celular.
- El mecanismo de funcionamiento exacto de la prueba aún no se comprende con claridad; sin embargo, se ha planteado la hipótesis de que las sales biliares facilitan la lisis de las células neumocócicas al activar la enzima autolítica.
Microorganismos probados
- Cualquier coco alfa-hemolítico, catalasa negativo, grampositivo en cadenas, que tenga la depresión central característica (centro aplanado) o morfología de colonia mucoide sugestiva de S. pneumonia.
- Cualquier coco grampositivo en pares en forma de lanceta de un hemocultivo positivo.
Medios, reactivos y suministros utilizados
Reactivos
- Sales biliares
- Se puede comprar o preparar una solución de sal biliar al 10%. La sal biliar se puede preparar agregando 10 gramos de desoxicolato de sodio en 100 ml de agua destilada.
- Luego, la solución debe dispensarse en pequeñas cantidades para minimizar la contaminación. La vida útil de la solución suele ser de 270 días.
- El almacenamiento debe realizarse entre 15 y 30 ° C. El almacenamiento del reactivo a temperaturas frías puede resultar en el espesamiento del reactivo.
- NaCl al 0,85% (esterilizado)
- Medio de cultivo en caldo (p. Ej., BHI)
Suministros
- Bucles
- Tubos de ensayo o portaobjetos
- Pipetas
Procedimiento de prueba de solubilidad biliar
La prueba de solubilidad biliar se puede realizar mediante el método del tubo de ensayo o el método de placa directa o el método de cultivo de sangre directo en portaobjetos.
Método del tubo de ensayo
- Se dispensan aproximadamente 0,5 ml de solución salina estéril o caldo adecuado en un tubo de ensayo pequeño.
- Se prepara una suspensión espesa del organismo en la solución salina (equivalente al estándar de McFarland n. ° 1). Luego, la suspensión se agita a mano o en un vórtice para formar una suspensión uniforme.
- La suspensión se divide en dos tubos, uno con la etiqueta “PRUEBA” y el otro con la etiqueta “CONTROL”.
- Se dispensan de dos a cinco gotas de reactivo biliar en los tubos marcados como “PRUEBA” y “CONTROL”. Ambos tubos se mezclan suavemente.
- A continuación, los tubos se incuban durante tres horas a 35 ° C, comprobando cada hora para aclarar, o cada tubo puede examinarse mediante tinción de Gram o montaje húmedo con azul de metileno para la lisis de las células en un intervalo de 15 minutos.
Método de placa directa
- Se coloca una gota de reactivo biliar cerca de una colonia sospechosa de 18 a 24 horas.
- A continuación, la gota se hace rodar suavemente sobre varias colonias representativas inclinando la placa. Las colonias no deben desprenderse con el reactivo biliar.
Nota : No toque la superficie del agar con la punta del gotero de reactivo biliar.
- La placa se mantiene boca arriba y se incuba a 35 ° C durante 15-30 minutos o hasta que la gota se haya evaporado. La placa también se puede colocar sobre un bloque de calor como sustituto del uso de una incubadora.
- Se observa el aplanamiento de la colonia. Se debe hacer una observación adecuada para asegurarse de que la colonia no se aleje flotando.
Prueba de hemocultivo en portaobjetos directo
- Se agrega una gota de caldo de hemocultivo a 1 gota de reactivo biliar en un portaobjetos de vidrio y se deja secar.
- Como control, se agrega una gota de caldo de cultivo de sangre a 1 gota de agua y se deja secar.
- La suspensión resultante se tiñe con Gram y se examina en busca de cocos.
Control de calidad
Como forma de control de calidad para la prueba de solubilidad en bilis, se pueden tomar dos organismos diferentes como control positivo y negativo.
Control | Incubación | Resultados |
steotococos neumonia | Incubación aeróbica durante 24-48 horas a 33-37 ° C. | Crecimiento positivo; las colonias se disuelven después de aproximadamente 30 minutos de la adición del reactivo biliar. |
Streptococcus mutans | Incubación aeróbica durante 24-48 horas a 33-37 ° C. | Crecimiento positivo; las colonias permanecen intactas después de aproximadamente 30 minutos de la adición del reactivo biliar. |
Interpretación de los resultados de la prueba de solubilidad en bilis
Método del tubo de ensayo
- La solubilidad de la bilis se demuestra en el método del tubo de ensayo como una eliminación o pérdida de turbidez, en comparación con el tubo de “CONTROL”, en 3 horas. También puede estar indicado por la lisis de células cuando se observa microscópicamente.
Método de cultivo de sangre en portaobjetos directo
- Si todos los cocos del frotis se lisan por completo y el frotis de control muestra bacterias intactas, el organismo es soluble en bilis.
Método de placa directa
- La solubilidad de la bilis se demuestra como la desintegración o aplanamiento de la colonia en 30 min, dejando un área de alfa- hemólisis donde se ubicaron las colonias.
- Se demuestra un resultado negativo cuando no hay cambios en la integridad de la colonia dentro de los 30 min.
Informe de resultados
- Si la prueba de la mancha o del tubo demuestra la solubilidad en bilis de una colonia alfa-hemolítica de un coco grampositivo con forma de lanceta y catalasa negativa, notifíquelo definitivamente como Streptococcus pneumoniae .
- Si la prueba no demuestra la solubilidad de la bilis, es probable que el microorganismo sea un estreptococo del grupo viridans, pero un porcentaje de los microorganismos resistentes a la bilis aún puede ser S. pneumoniae ; Se recomienda realizar más pruebas a partir de colonias neumocócicas típicas.
Usos de la prueba de solubilidad de la bilis
- La prueba de solubilidad de la bilis se utiliza para determinar la capacidad de un organismo de someterse a lisis en presencia de sales biliares.
- Esta prueba se puede utilizar para la diferenciación e identificación de S. pneumoniae de otros estreptococos alfa-hemolíticos.
- Esta prueba es una prueba cualitativa para la diferenciación de organismos solubles en bilis e insolubles en bilis.
Limitaciones de la prueba de solubilidad biliar
- Es posible que algunos organismos de S. pneumoniae no se lisen en presencia de bilis, posiblemente debido a la pérdida del factor de virulencia o de la cápsula. Si no hay lisis, el aislado aún puede ser S. pneumoniae . Por lo tanto, las colonias que se asemejan a S. pneumonia y que no son solubles en bilis deben identificarse con otro método, como la susceptibilidad a la optoquina o la sonda de ADN y la espectrometría de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF).
- La prueba de solubilidad en bilis solo debe usarse para diferenciar S. pneumoniae de otros estreptococos alfa-hemolíticos.
- Para obtener la mayor especificidad, las cepas positivas en la prueba de tubo y las cepas negativas en la prueba puntual deben confirmarse con una prueba de disco de optoquina o una sonda de ADN o MALDI-TOF.
- La autólisis normal de S. pneumoniae puede inhibirse por una alta concentración de sales biliares. La evaporación puede hacer que el reactivo se vuelva más concentrado, afectando así la prueba.
- La prueba de solubilidad en bilis no es confiable con cultivos antiguos que se han autolizado.
- Al realizar la prueba en tubo de solubilidad en bilis con solución salina o caldo sin tampón, es fundamental ajustar el pH a neutro antes de añadir el reactivo, para evitar reacciones falsas negativas.
- Al realizar la prueba con el método de la placa, se debe tener cuidado de no desalojar la colonia que se está analizando, lo que daría lugar a resultados falsos positivos. Si la placa directa es difícil de interpretar, la prueba debe repetirse usando el método de tubo o portaobjetos.
- El almacenamiento del reactivo a bajas temperaturas puede hacer que se espese. La botella de reactivo debe calentarse en una incubadora a 37 ° C para licuar el reactivo antes de su uso.
Dr. Martin Passen, a dedicated nutrition educator with a master’s in nutrition education and nearing completion of a clinical nutrition and dietetics master’s. Passionate about sharing valuable information effectively.