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Definición de la prueba de saturación de sal
La prueba de saturación de sal es una prueba para la precipitación de proteínas y su diferenciación de otras proteínas mediante la técnica de salting-out. La salazón es el proceso de precipitación de proteínas aumentando la concentración de sal en la solución. Las sales utilizadas en esta técnica son en su mayoría sales minerales neutras como MgSO 4 , Na 2 SO 4 y (NH) 2 SO 4. La prueba de solubilización de la sal también ayuda en la diferenciación de proteínas, ya que algunas proteínas precipitan bajo concentraciones de sal más bajas, mientras que otras requieren concentraciones más altas. El reactivo utilizado para la prueba puede diferir dependiendo de la preferencia con sales como el sulfato de amonio que se utilizan debido a su mayor solubilidad. La prueba de saturación de sal se puede realizar como media saturación o saturación completa, dependiendo del tipo de proteínas que se detecten. En la semisaturación, la solución está medio saturada con la sal, pero en plena saturación, la solución está completamente saturada con la sal.
Objetivos de la prueba de saturación de sal
- Detectar la presencia de proteínas en una muestra determinada.
- Diferenciar entre proteínas como la albúmina y la globulina.
- Purificar y fraccionar grandes lotes de proteínas en función de su solubilidad.
Principio de la prueba de saturación de sal
Las proteínas son de naturaleza coloidal debido a la presencia de una gran cantidad de cargas eléctricas que crean repulsión, evitando la coalescencia de las partículas. De manera similar, también se forma una capa de hidratación alrededor de cada molécula de proteína donde las proteínas están rodeadas por películas de moléculas de agua. El mecanismo de la técnica de salazón es la solvatación preferencial de las moléculas de sal mediante la exclusión de la capa de hidratación alrededor de las moléculas de proteína. Cuando se agregan sales orgánicas a la solución, la concentración de agua efectiva disponible para las proteínas disminuye, lo que eventualmente conduce a la precipitación de las proteínas. Hay dos mecanismos diferentes involucrados en el proceso.
Al principio, la mayor concentración de sales minerales elimina osmóticamente el agua de la capa de hidratación alrededor de las proteínas, lo que luego agota la capa inmovilizada de agua que rodea a cada una de las partículas de proteína. En segundo lugar, los cationes y aniones de las sales minerales se unen con los respectivos grupos contraiónicos de las partículas de proteína para reducir las cargas superficiales de las proteínas. Ambos mecanismos ayudan en la agregación y precipitación de partículas de proteína. La concentración de sal necesaria para la precipitación de proteínas depende del área de superficie de las proteínas. Las moléculas más pequeñas como la albúmina tienen una superficie más grande que requiere una mayor concentración de sal, mientras que las moléculas más grandes como la caseína, la gelatina y la globulina tienen una superficie más pequeña y requieren concentraciones más pequeñas.
Requisitos
Reactivo
- Sulfato de amonio sólido
- Solución de saturación de sulfato de amonio
- Hidróxido de sodio al 40%
- Solución de sulfato de cobre al 1%
- Solución de muestra
Materiales necesarios
- Tubo de ensayo
- Soporte para tubos de ensayo
- Cuentagotas
- Pipetas
- Papel de filtro
Procedimiento de prueba de saturación de sal
Para la mitad de la saturación
- En un tubo de ensayo se toman 3 ml de la solución de ensayo. A esto se le añaden 3 ml de la solución saturada de sulfato de amonio.
- La solución se mezcla correctamente y se deja reposar durante unos 5 minutos.
- Luego, la solución se filtra para eliminar el residuo formado del resto del filtrado.
- La prueba de Biuret se realiza sobre el resto del filtrado.
Saturación completa
- En un tubo de ensayo se toman 3 ml de la solución de ensayo. A esto, se le añade una cierta cantidad de sulfato de amonio sólido.
- Luego, la solución se mezcla agitando hasta que la sal sólida se disuelva. El sulfato de amonio sólido se agrega continuamente hasta que no se pueda disolver más sal.
- A continuación, se deja reposar la solución durante cinco minutos, seguido de la filtración del residuo.
- La prueba de Biuret se realiza sobre el filtrado.
Resultado e interpretación de la prueba de saturación de sal
Saturación media
- La formación de un precipitado blanco en la solución bajo semisaturación indica un resultado positivo. Este resultado confirma la presencia de globulina en la solución.
- La ausencia del precipitado blanco representa un resultado negativo, lo que indica la ausencia de globulina en la muestra.
- Si se forma un color púrpura durante la prueba de Biuret, muestra que hay otras proteínas presentes en la solución. Una prueba de Biuret negativa indica la ausencia de otras proteínas.
Saturación completa
- La formación de un precipitado blanco en la solución bajo saturación total indica un resultado positivo. Este resultado confirma la presencia de albúmina en la solución.
- La ausencia del precipitado blanco representa un resultado negativo, lo que indica la ausencia de albúmina en la muestra.
- Si se forma un color púrpura durante la prueba de Biuret, muestra que hay otras proteínas presentes en la solución. Una prueba de Biuret negativa indica la ausencia de otras proteínas.
Usos de la prueba de saturación de sal
- La prueba de saturación de sal se puede utilizar para la detección de proteínas como albúmina y globulina.
- Como la precipitación de proteínas en la prueba se debe a una solubilidad reducida y no a una desnaturalización, se pueden usar proteínas precipitadas para detectar la concentración de las proteínas.
- La prueba también se puede utilizar como un método de purificación de proteínas para la eliminación de lípidos o ácidos nucleicos unidos.
- Las sales minerales utilizadas en la prueba ayudan en la estabilización de proteínas mediante solvatación preferencial. Las sales como (NH) 2 SO 4 también inhiben el crecimiento bacteriano y la actividad proteasa de las proteínas.
Limitaciones de la prueba de saturación de sal
- Al usar sulfato de amonio sólido, se pueden formar grumos en la solución. Para evitarlo, conviene utilizar mortero.
- El uso de sales minerales de bajo grado puede causar contaminación con metales pesados que inhiben el proceso de precipitación.
- Se pueden utilizar calculadoras en línea para determinar las cantidades de sulfato de amonio sólido necesarias para la saturación.
- El uso de sulfato de amonio puede provocar la acidificación de la solución, lo que ralentiza el proceso; por lo tanto, se puede agregar tampón Tris.
Dr. Martin Passen, a dedicated nutrition educator with a master’s in nutrition education and nearing completion of a clinical nutrition and dietetics master’s. Passionate about sharing valuable information effectively.