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Definición de la prueba de desoxirribonucleasa (DNasa)
La prueba de desoxirribonucleasa (DNasa) es una prueba bioquímica que se realiza para diferenciar los organismos en función de su capacidad para producir la enzima DNasa.
- El ácido desoxirribonucleico (ADN) es un polímero de gran tamaño molecular compuesto por monómero de múltiples nucleótidos que es de gran tamaño y, por lo tanto, no puede ingresar a la membrana celular bacteriana.
- Los microorganismos producen la enzima desoxirribonucleasa para descomponer el ADN en monómeros más pequeños que luego pueden introducirse en la célula fácilmente.
- Los nucleótidos se utilizan para producir ácido nucleico para las bacterias, así como una fuente de nitrógeno, fósforo y carbono.
- Algunos microorganismos pueden incluso producir ADNasa extracelular que descompone el ADN más grande en unidades monoméricas más pequeñas para que puedan ser introducidas en la célula a través de las proteínas de transporte presentes en la membrana celular.
- La degradación del ADN también se considera un factor de virulencia, ya que provoca la degradación del ADN del huésped.
- Por tanto, la capacidad de producir ADNasa se puede utilizar para diferenciar entre diferentes microorganismos patógenos.
- La prueba de DNasa es una prueba importante para la presunta identificación de Staphylococcus aureus y la diferencia de otras especies de estafilococos.
Objetivos de la desoxirribonucleasa (DNasa)
- Determinar la capacidad de un organismo para producir la enzima DNasa.
- Diferenciar e identificar S. aureus de otras especies de estafilococos.
Principio de desoxirribonucleasa (DNasa)
- Las ADNasas son enzimas que hidrolizan el ADN y liberan nucleótidos libres y fosfato.
- La enzima desoxirribonucleasa producida por las bacterias son endonucleasas extracelulares que descomponen el ADN, produciendo una alta concentración de oligonucleótidos.
- Los medios utilizados para detectar estas enzimas pueden elaborarse utilizando varios indicadores (azul de toluidina o verde de metilo) o ningún indicador para detectar la hidrólisis del ADN.
- El primer método se realiza sin indicador. La hidrólisis del ADN está indicada por el aclaramiento del agar después de la adición de HCl (los oligonucleótidos se disuelven en ácido provocando una zona clara, pero las sales de ADN son insolubles).
- Cuando se agrega el indicador verde de metilo, el ADN se combina con el verde de metilo para producir un color verde.
- El complejo se libera cuando el ADN se hidroliza y el verde de metilo liberado es incoloro a pH 7,5.
- Cuando se agrega azul de toluidina O (TBO), se forma un complejo con el ADN, que cambia su estructura cuando el ADN se hidroliza, dando como resultado un color rosa brillante.
- Los medios con tintes pueden inhibir cierto crecimiento microbiano. El uso de un inóculo pesado previene este problema y hace que la prueba sea más rápida, ya que detecta enzimas preformadas.
- Staphylococcus aureus posee una enzima termoestable, una termonucleasa. Para detectar esta enzima, primero, los organismos son destruidos por el calor y luego la ADNasa libre reacciona con el medio.
Microorganismos probados
- Bacilos gramnegativos que sugieren Stenotrophomonas maltophilia (positivo) y son resistentes a la colistina o polimixina B para separarse de Burkholderia cepacia (negativo).
- Diplococos gramnegativos presuntivos de Moraxella catarrhalis (positivos).
- Cocos grampositivos que se presumen para S. aureus (positivos) y son difíciles de separar de otras especies de estafilococos estrechamente relacionadas y tienen una reacción de coagulasa cuestionable. Es posible que algunos estafilococos no crezcan en medios con tintes, por lo que se puede utilizar el método sin el indicador.
- Enterobacteriaceae para identificar Serratia (positivo) y separarlas de Klebsiella spp. y Enterobacter spp. Serratia fonticola es la única Serratia sp. eso es negativo para DNasa.
- Bacilos gramnegativos , indol positivos, oxidasa positivospara separar Aeromonas y Vibrio cholerae (DNasa positivo) de Plesiomonas shigelloides (DNasa negativo).
Medios, reactivos y suministros utilizados
Medios utilizados
- La base de agar de prueba de DNasa se utiliza para probar la producción de la enzima DNasa. El medio también se puede agregar con indicadores como verde de metilo o azul de toluidina O.
- La composición de la base de agar de prueba de DNasa se indica a continuación:
SN | Ingredientes | Gramo / litro |
1. | Triptona | 15.0 |
2. | Peptona de soja | 5,0 |
3. | Ácido desoxirribonucleico (ADN) | 2.0 |
4. | Cloruro de sodio | 5,0 |
5. | Agar bacteriológico | 15.0 |
PH final a 25 ° C: 7,3 ± 0,2 |
Reactivo utilizado
- HCl 1 N
Suministros utilizados
- Palillos, agujas o asas de inoculación estériles
- Pipetas Pasteur o pajitas para beber
- Bloque de calor hirviendo
- Incubadoras a 35 y 30 ° C
Procedimiento de desoxirribonucleasa (DNasa)
A. Preparación de los medios
- En un vaso de precipitados, se añaden 42 gramos del polvo deshidratado o del medio preparado en el laboratorio a 1000 mililitros de agua pura destilada o desionizada.
- La suspensión se calienta con agitación para llevarla a ebullición con el fin de disolver completamente el medio.
- A continuación, el medio disuelto se esteriliza en autoclave a una presión de 15 libras (121 ° C) durante 15 minutos.
- Una vez que se completa el proceso de esterilización en autoclave, el vaso de precipitados se saca y se enfría a una temperatura de aproximadamente 40-45 ° C.
- A continuación, el medio se vierte en placas de Petri estériles en condiciones estériles.
- Si se van a agregar indicadores, se añaden 0,1 gramos de toluidina O o verde de metilo al medio antes de esterilizarlo.
B. Prueba de DNasa
Sin indicador
- Las placas de agar se inoculan con el organismo de prueba de un cultivo de 18 horas con un asa o aguja de inoculación estéril.
- Las placas se incuban a 35-37 ° C durante 24 horas.
- Las placas de agar incubadas se inundaron con una solución de HCl 1 N y se vertió el exceso de ácido.
- Se deja algún tiempo para que el reactivo se absorba en las placas.
- Se observa en las placas una zona clara alrededor de las colonias en 5 minutos.
Con indicador
- Las placas de agar con indicador se inoculan con el organismo de prueba de un cultivo de 18 horas con un asa o aguja de inoculación estéril.
- Las placas se incuban durante 24 horas a 35-37 ° C.
- A continuación, se observan las placas para ver el cambio de color del indicador.
Interpretación de resultados de desoxirribonucleasa (DNasa)
Sin indicador
- Una zona clara alrededor de las colonias demuestra una prueba positiva después de la adición de HCl 1N.
- Una prueba negativa es la ausencia de una zona clara después de la adición de HCl 1N.
Con indicador (azul de toluidina O)
- Una prueba positiva se demuestra por el desarrollo de un halo rosado o rojo alrededor de la colonia o del pozo en el agar.
- Una prueba negativa se demuestra por la ausencia de cambios en el color azul real del medio.
SN | Organismo | Crecimiento | Resultado |
1. | Serratia marcescens | Exuberante | Prueba positiva; cambia de color de azul a rosa alrededor de las colonias cuando se usa azul de toluidina / zona clara alrededor de las colonias cuando las placas se inundan con HCl 1N. |
2. | Staphylococcus aureus subsp . aureus | Exuberante | Prueba positiva; cambia de color de azul a rosa alrededor de las colonias cuando se usa azul de toluidina / zona clara alrededor de las colonias cuando las placas se inundan con HCl 1N. |
3. | Staphylococcus epidermidis | Bien | Negativo; sin cambio de color / np aclarado alrededor de las colonias. |
4. | Streptococcus pyogenes | Exuberante | Prueba positiva; cambia de color de azul a rosa alrededor de las colonias cuando se usa azul de toluidina / zona clara alrededor de las colonias cuando las placas se inundan con HCl 1N. |
Usos de desoxirribonucleasa (DNasa)
- La prueba de DNasa se utiliza para detectar la capacidad de un organismo para producir la enzima DNasa.
- Esta prueba también se puede utilizar para diferenciar S. aureus de otras especies de estafilococos.
- Se utiliza para diferenciar Serratia spp. ya que produce una DNasa, que separa las cepas no pigmentadas de la mayoría de las otras Enterobacteriaceae.
Limitaciones de la desoxirribonucleasa (DNasa)
- Un inóculo amplio o grande puede resultar en una decoloración completa del medio, como resultado de la reducción del tinte. En este caso, la prueba debe repetirse.
- El medio con verde de metilo es mejor para los organismos, como los bacilos gramnegativos, que primero crecen en el medio y luego demuestran una prueba positiva.
- Para Moraxella y cocos grampositivos con prueba de verde de toulidina O, un inóculo bajo puede resultar en una prueba falsamente negativa, ya que estos organismos pueden no crecer bien en el medio.
Dr. Martin Passen, a dedicated nutrition educator with a master’s in nutrition education and nearing completion of a clinical nutrition and dietetics master’s. Passionate about sharing valuable information effectively.