- El polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) es una técnica en la que los organismos pueden diferenciarse mediante el análisis de patrones derivados de la escisión de su ADN .
- Es una técnica que aprovecha las variaciones en las secuencias de ADN homólogas.
- Un polimorfismo de longitud de un fragmento de restricción se define por la existencia de alelos alternativos asociados con fragmentos de restricción que difieren en tamaño entre sí. Simplemente, las variaciones en la longitud de los fragmentos de ADN de restricción entre individuos de una especie se denominan RFLP.
- La técnica básica para identificar tales polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción implica la fragmentación de una muestra de ADN mediante una enzima de restricción, que puede reconocer y cortar el ADN dondequiera que ocurra una secuencia corta específica, en un proceso conocido como digestión de restricción.
- Los fragmentos de ADN resultantes se separan luego por longitud mediante un proceso conocido como electroforesis en gel de agarosa y se transfieren a una membrana mediante el procedimiento de transferencia Southern. La hibridación de la membrana con una sonda de ADN marcada determina entonces la longitud de los fragmentos que son complementarios a la sonda.
- Un RFLP ocurre cuando la longitud de un fragmento detectado varía entre individuos.
- Aunque ahora en gran parte obsoleto debido al auge de las tecnologías de secuenciación de ADN económicas, el análisis RFLP fue la primera técnica de creación de perfiles de ADN lo suficientemente económica como para buscar una aplicación generalizada.
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Principio de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)
Si dos organismos difieren en la distancia entre los sitios de escisión de una endonucleasa de restricción particular, la longitud de los fragmentos producidos será diferente cuando el ADN se digiera con una enzima de restricción. La similitud y las diferencias de los patrones así generados se pueden utilizar para diferenciar especies (e incluso cepas) unas de otras.
Pasos involucrados en el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)
- El primer paso en este proceso es aislar el ADN del objetivo.
- Una vez que el ADN se aísla de la muestra, se somete a digestión por restricción utilizando enzimas de restricción.
- La muestra de ADN digerida se somete luego a electroforesis en gel , en la que el ADN se separa en función de su tamaño. Se producen muchos fragmentos de ADN con ligeras diferencias de longitud.
- Luego, el gel se expone a una sustancia química para desnaturalizar el ADN de doble hebra y convertirlo en monocatenario.
- A esto le sigue una transferencia Southern en la que el ADN se transfiere del gel a la membrana de nailon.
- A continuación, la membrana de nailon se expone a una solución con sondas de nucleótidos complementarios radiactivos que se hibridan con secuencias de ADN elegidas específicamente en la membrana de nailon.
- Luego, la membrana se coloca contra la película de rayos X, donde las sondas radiactivas hibridadas provocan la exposición de la película de rayos X, lo que produce un autorradiograma.
- El análisis RFLP se lleva a cabo para detectar diferencias en el patrón para confirmar polimorfismos.
Aplicaciones del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)
El análisis RFLP era anteriormente una herramienta importante en el mapeo del genoma, la localización de genes para trastornos genéticos, la determinación del riesgo de enfermedad y las pruebas de paternidad.
RFLP se puede utilizar en muchos entornos diferentes para lograr diferentes objetivos:
- En casos de paternidad o casos penales para determinar el origen de una muestra de ADN. (es decir, tiene aplicaciones forenses).
- Determinación del estado de enfermedad de un individuo. (por ejemplo, puede usarse en la detección de mutaciones)
- Medir las tasas de recombinación que pueden conducir a un mapa genético con la distancia entre los loci RFLP.
- En la caracterización de la diversidad genética o patrones de reproducción en poblaciones animales.
- RFLP se ha desarrollado para el mapeo de cromosomas de humanos, ratones, maíz, tomate, arroz, etc.
Ventajas del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)
- La principal ventaja del análisis RFLP sobre los protocolos basados en PCR es que no se requiere información de secuencia previa ni síntesis de oligonucleótidos.
- Los resultados se basan en características genotípicas fiables más que en fenotipos.
- Marcador genético basado en RFLP
- El RFLP es el marcador codominante, por lo que puede estimar la heterocigosidad.
- RFLP & es un estudio muy útil en la secuencia de ADN genómico.
- Metodología muy robusta con buena transferibilidad entre laboratorios.
Limitaciones del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP)
- Lento
- Incómodo
- Requiere una gran cantidad de muestra de ADN.
- La automatización no es posible
- Bajos niveles de polimorfismo en algunas especies.
- Pocos loci detectados por ensayo
- Necesita una biblioteca de sondas adecuada
- Necesita el proceso combinado de marcaje de sonda, fragmentación de ADN, electroforesis, transferencia, hibridación, lavado y autorradiografía.
Dr. Martin Passen, a dedicated nutrition educator with a master’s in nutrition education and nearing completion of a clinical nutrition and dietetics master’s. Passionate about sharing valuable information effectively.