Primera estructura atómica de un virus intacto descifrada con un láser de rayos X

Un método experimental innovador acelerará sustancialmente el análisis de proteínas

Un equipo internacional de científicos ha utilizado por primera vez un láser de electrones libres de rayos X para desentrañar la estructura de una partícula de virus intacta a nivel atómico. El método utilizado reduce drásticamente la cantidad de material viral requerido, al mismo tiempo que permite que las investigaciones se lleven a cabo varias veces más rápido que antes. Esto abre oportunidades de investigación completamente nuevas, como informa el equipo de investigación dirigido por el científico de DESY Alke Meents en la revista Nature Methods .

En el campo conocido como biología estructural, los científicos examinan la estructura tridimensional de las moléculas biológicas para determinar cómo funcionan. Este conocimiento mejora nuestra comprensión de los procesos biológicos fundamentales que tienen lugar dentro de los organismos, como la forma en que las sustancias se transportan dentro y fuera de una célula, y también se puede utilizar para desarrollar nuevos fármacos. “Conocer la estructura tridimensional de un Una molécula como una proteína ofrece una gran perspectiva de su comportamiento biológico”, explica el coautor David Stuart, Director de Ciencias de la Vida en la instalación de sincrotrón Diamond Light Source en el Reino Unido y profesor de la Universidad de Oxford.

La cristalografía de rayos X es, con mucho, la herramienta más prolífica utilizada por los biólogos estructurales y ya ha revelado las estructuras de miles de moléculas biológicas. Se cultivan pequeños cristales de la proteína de interés y luego se iluminan con rayos X de alta energía. Los cristales difractan los rayos X de formas características, de modo que los patrones de difracción resultantes se pueden utilizar para deducir la estructura espacial del cristal y, por tanto, de sus componentes, a escala atómica. Sin embargo, los cristales de proteína no son tan estables y resistentes como los cristales de sal, por ejemplo. Son difíciles de cultivar, a menudo permanecen pequeños y se dañan fácilmente con los rayos X.

“Los láseres de rayos X han abierto un nuevo camino hacia la cristalografía de proteínas, porque sus pulsos extremadamente intensos se pueden usar para analizar incluso cristales extremadamente pequeños que no producirían una imagen de difracción lo suficientemente brillante usando otras fuentes de rayos X”, agrega el coautor. Armin Wagner de Diamond Light Source. Sin embargo, cada uno de estos microcristales solo puede producir una sola imagen de difracción antes de que se evapore como resultado del pulso de rayos X. Sin embargo, para realizar el análisis estructural, se necesitan cientos o incluso miles de imágenes de difracción. En tales experimentos, los científicos inyectan un fino chorro líquido de cristales de proteína a través de un láser de rayos X pulsado, que libera una secuencia rápida de ráfagas extremadamente cortas. Cada vez que un pulso de rayos X golpea un microcristal, se produce y registra una imagen de difracción.

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Este método es muy exitoso y ya se ha utilizado para determinar la estructura de más de 80 biomoléculas. Sin embargo, la mayor parte del material de muestra se desperdicia. “La tasa de aciertos suele ser inferior al dos por ciento de los pulsos, por lo que la mayoría de los preciosos microcristales terminan sin usarse en el contenedor de recolección”, dice Meents, que trabaja en el Centro para la Ciencia del Láser de Electrones Libres (CFEL) en Hamburgo. una cooperación de DESY, la Universidad de Hamburgo y la Sociedad Alemana Max Planck. Por lo tanto, el método estándar normalmente requiere varias horas de tiempo de haz y cantidades significativas de material de muestra.

Para utilizar el tiempo de haz limitado y el valioso material de muestra de manera más eficiente, el equipo desarrolló un nuevo método. Los científicos utilizan un chip microdiseñado que contiene miles de pequeños poros para contener los cristales de proteína. Luego, el láser de rayos X escanea el chip línea por línea e, idealmente, esto permite registrar una imagen de difracción para cada pulso del láser. El equipo de investigación probó su método en dos muestras de virus diferentes usando el láser de rayos X LCLS en el SLAC National Accelerator Laboratory en EE. UU., que produce 120 pulsos por segundo. Cargaron su portamuestras con una pequeña cantidad de microcristales del enterovirus bovino 2 (BEV2), un virus que puede causar abortos espontáneos, mortinatos e infertilidad en el ganado, y que es muy difícil de cristalizar.

En este experimento, los científicos lograron una tasa de aciertos, donde el láser de rayos X apuntó con éxito al cristal, de hasta el nueve por ciento. En solo 14 minutos habían recopilado suficientes datos para determinar la estructura correcta del virus, que ya se conocía a partir de experimentos con otras fuentes de luz de rayos X, hasta una escala de 0,23 nanómetros (millonésimas de milímetro).

“Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se determina la estructura atómica de una partícula de virus intacta utilizando un láser de rayos X”, señala Meents. “Mientras que los métodos anteriores en otras fuentes de luz de rayos X requerían cristales con un volumen total de 3,5 nanolitros, logramos usar cristales que eran más de diez veces más pequeños, con un volumen total de solo 0,23 nanolitros”.

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Este experimento se realizó a temperatura ambiente. Mientras que enfriar los cristales de proteína los protegería hasta cierto punto del daño por radiación, esto generalmente no es factible cuando se trabaja con cristales de virus extremadamente sensibles. Sin embargo, los cristales de proteínas virales aisladas pueden congelarse y, en una segunda prueba, los investigadores estudiaron la proteína polihedrina viral que forma un cuerpo de oclusión viral para varios miles de partículas virales de ciertas especies. Las partículas de virus utilizan estos contenedores para protegerse contra las influencias ambientales y, por lo tanto, pueden permanecer intactas durante mucho más tiempo.

Para la segunda prueba, el científico cargó su chip con cristales de poliedrina y los examinó usando el láser de rayos X mientras mantenía el chip a temperaturas por debajo de -180 grados centígrados. Aquí, los científicos lograron una tasa de éxito de hasta el 90 por ciento. En solo diez minutos habían registrado imágenes de difracción más que suficientes para determinar la estructura de la proteína con una precisión de 0,24 nanómetros. “Para la estructura de la poliedrina, solo tuvimos que escanear un solo chip que estaba cargado con cuatro microgramos de cristales de proteína; es decir, órdenes de magnitud menos que la cantidad que normalmente se necesitaría”, explica Meents. “Nuestro enfoque no solo reduce el tiempo de recopilación de datos y la cantidad de muestra necesaria, sino que también abre la oportunidad de analizar virus completos utilizando X- rayos láser”, resume Meents. Los científicos ahora quieren aumentar la capacidad de su chip por un factor de diez, de 22 500 a unos 200 000 microporos, y aumentar aún más la velocidad de escaneo hasta mil muestras por segundo. Esto aprovecharía mejor el potencial del nuevo láser de electrones libres de rayos X europeo XFEL, que acaba de entrar en funcionamiento en la región de Hamburgo y que será capaz de producir hasta 27.000 pulsos por segundo. Además, la próxima generación de chips solo expondrá los microporos que se están analizando actualmente, para evitar que los cristales restantes se dañen por la radiación dispersa del láser de rayos X. Esto aprovecharía mejor el potencial del nuevo láser de electrones libres de rayos X europeo XFEL, que acaba de entrar en funcionamiento en la región de Hamburgo y que será capaz de producir hasta 27.000 pulsos por segundo. Además, la próxima generación de chips solo expondrá los microporos que se están analizando actualmente, para evitar que los cristales restantes se dañen por la radiación dispersa del láser de rayos X. Esto aprovecharía mejor el potencial del nuevo láser de electrones libres de rayos X europeo XFEL, que acaba de entrar en funcionamiento en la región de Hamburgo y que será capaz de producir hasta 27.000 pulsos por segundo. Además, la próxima generación de chips solo expondrá los microporos que se están analizando actualmente, para evitar que los cristales restantes se dañen por la radiación dispersa del láser de rayos X.

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Investigadores de la Universidad de Oxford, la Universidad del Este de Finlandia, el Instituto Paul Scherrer de Suiza, el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley de EE. UU. y SLAC también participaron en la investigación. Los científicos de Diamond han colaborado con el equipo de DESY, y gran parte del desarrollo y las pruebas del chip microdiseñado se realizan en las líneas de luz I02 e I24 de Diamond.

Referencia:
cristalografía de virus en serie de objetivo fijo de alta velocidad ; Philip Roedig, Helen M. Ginn, Tim Pakendorf, Geoff Sutton, Karl Harlos, Thomas S. Walter, Jan Meyer, Pontus Fischer, Ramona Duman, Ismo Vartiainen, Bernd Reime, Martin Warmer, Aaron S. Brewster, Iris D. Young, Tara Michels-Clark, Nicholas K. Sauter, Abhay Kotecha, James Kelly, David J. Rowlands, Marcin Sikorsky, Silke Nelson, Daniel S. Damiani, Roberto Alonso-Mori, Jingshan Ren, Elizabeth E. Fry, Christian David, David I Stuart, Armin Wagner y Alke Meents; Métodos de la naturaleza , 2017; DOI: 10.1038/nmet.4335

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