El método de imágenes rápidas podría ayudar a revelar cómo condiciones como el autismo afectan las células cerebrales.
Ana Trafton | Oficina de noticias del MIT
Nuestros cerebros contienen millones de sinapsis, las conexiones que transmiten mensajes de neurona a neurona. Dentro de estas sinapsis hay cientos de proteínas diferentes, y la disfunción de estas proteínas puede conducir a condiciones como la esquizofrenia y el autismo.
Investigadores del MIT y el Instituto Broad de Harvard y el MIT ahora han ideado una nueva forma de obtener imágenes rápidamente de estas proteínas sinápticas en alta resolución. Usando sondas de ácido nucleico fluorescente, pueden etiquetar y obtener imágenes de un número ilimitado de proteínas diferentes. Demostraron la técnica en un nuevo estudio en el que tomaron imágenes de 12 proteínas en muestras celulares que contenían miles de sinapsis.
“Las imágenes multiplexadas son importantes porque hay mucha variabilidad entre las sinapsis y las células, incluso dentro del mismo cerebro”, dice Mark Bathe, profesor asociado de ingeniería biológica del MIT. “Realmente necesitas observar simultáneamente las proteínas en la muestra para comprender cómo se ven las subpoblaciones de diferentes sinapsis, descubrir nuevos tipos de sinapsis y comprender cómo las afectan las variaciones genéticas”.
Los investigadores planean usar esta técnica a continuación para estudiar qué sucede con las sinapsis cuando bloquean la expresión de genes asociados con enfermedades específicas, con la esperanza de desarrollar nuevos tratamientos que puedan revertir esos efectos.
Bathe y Jeff Cottrell, director de investigación traslacional en el Centro Stanley para la Investigación Psiquiátrica en el Instituto Broad, son los autores principales del estudio, que aparece hoy en Nature Communications . Los autores principales del artículo son los exposdoctorados Syuan-Ming Guo y Remi Veneziano, el exestudiante de posgrado Simon Gordonov y el exinvestigador científico Li Li.
Imágenes con ADN
Las proteínas sinápticas tienen una variedad de funciones. Muchos de ellos ayudan a formar andamios sinápticos, que están involucrados en la secreción de neurotransmisores y el procesamiento de señales entrantes. Si bien las sinapsis contienen cientos de estas proteínas, la microscopía de fluorescencia convencional se limita a obtener imágenes de cuatro proteínas como máximo a la vez.
Para aumentar ese número, el equipo del MIT desarrolló una nueva técnica basada en un método existente llamado PINTURA DE ADN. Utilizando este método, ideado originalmente por Ralf Jungmann del Instituto Max Planck de Bioquímica, los investigadores etiquetan proteínas u otras moléculas de interés con una sonda de ADN-anticuerpo. Luego, toman imágenes de cada proteína mediante la entrega de un “oligo” de ADN fluorescente que se une a las sondas de ADN-anticuerpo.
Las hebras de ADN tienen una afinidad intrínsecamente baja entre sí, por lo que se unen y se desatan periódicamente, creando una fluorescencia parpadeante que se puede visualizar mediante microscopía de superresolución. Sin embargo, la obtención de imágenes de cada proteína lleva aproximadamente media hora, por lo que no es práctico para obtener imágenes de muchas proteínas en una muestra grande.
Bathe y sus colegas se propusieron crear un método más rápido que les permitiera analizar una gran cantidad de muestras en un corto período de tiempo. Para lograrlo, alteraron la sonda de imágenes de tinte de ADN para que se uniera más estrechamente al anticuerpo de ADN, utilizando lo que se llama ácidos nucleicos bloqueados. Esto da una señal mucho más brillante, por lo que la imagen se puede hacer más rápidamente, pero con una resolución ligeramente más baja.
“Cuando hacemos 12 o 15 colores en un solo pozo de neuronas, todo el experimento toma una hora, en comparación con la noche a la mañana para el equivalente de súper resolución”, dice Bathe.
Los investigadores utilizaron esta técnica para etiquetar 12 proteínas diferentes que se encuentran en la sinapsis, incluidas las proteínas de andamiaje, las proteínas asociadas con el citoesqueleto y las proteínas que se sabe que marcan las sinapsis excitatorias o inhibitorias. Una de las proteínas que observaron es shank3, una proteína de andamio que se ha relacionado tanto con el autismo como con la esquizofrenia .
Al analizar los niveles de proteínas en miles de neuronas, los investigadores pudieron determinar grupos de proteínas que tienden a asociarse entre sí con más frecuencia que otras, y aprender cómo las diferentes sinapsis varían en las proteínas que contienen. Ese tipo de información podría usarse para ayudar a clasificar las sinapsis en subtipos que podrían ayudar a revelar sus funciones.
“Inhibidor y excitatorio son los tipos de sinapsis canónicos, pero se especula que existen numerosos subtipos diferentes de sinapsis, sin ningún consenso real sobre cuáles son”, dice Bathe.
Entendiendo la enfermedad
Los investigadores también demostraron que podían medir los cambios en los niveles de proteína sináptica que ocurren después de que las neuronas se tratan con un compuesto llamado tetrodotoxina (TTX), que fortalece las conexiones sinápticas.
“Usando la inmunofluorescencia convencional, normalmente puede extraer información de tres o cuatro objetivos dentro de la misma muestra, pero con nuestra técnica, pudimos expandir ese número a 12 objetivos diferentes dentro de la misma muestra. Aplicamos este método para examinar la remodelación sináptica que ocurre después del tratamiento con TTX, y nuestro hallazgo corroboró el trabajo anterior que reveló una regulación positiva coordinada de las proteínas sinápticas después del tratamiento con TTX”, dice Eric Danielson, un postdoctorado senior del MIT y autor del estudio.
Los investigadores ahora están utilizando esta técnica, llamada PRISM, para estudiar cómo la estructura y la composición de las sinapsis se ven afectadas al anular un conjunto de genes que se informó anteriormente que confieren riesgo genético para el desarrollo de trastornos psiquiátricos. La secuenciación de los genomas de personas con trastornos como el autismo y la esquizofrenia ha revelado cientos de variantes genéticas vinculadas a enfermedades, y para la mayoría de esas variantes, los científicos no tienen idea de cómo contribuyen a la enfermedad.
“Con este enfoque, esperamos brindar una descripción más detallada de los cambios en la organización sináptica y los efectos de enfermedades compartidas asociados con estos genes”, dice Karen Pérez de Arce, científica investigadora del Instituto Broad y autora del estudio.
“Comprender cómo la variación genética afecta el desarrollo de las neuronas en el cerebro y su estructura y función sináptica es un gran desafío para la neurociencia y para comprender cómo surgen estas enfermedades”, agrega Bathe.
La investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud, incluida la Iniciativa NIH BRAIN, la Fundación Nacional de Ciencias, el Programa de Becarios de la Facultad Simons del Instituto Médico Howard Hughes, el Proyecto de Filantropía Abierta, el Laboratorio de Investigación del Ejército de EE. UU., la Fundación de Células Madre de Nueva York Robertson Award, y el Centro Stanley para la Investigación Psiquiátrica.
Otros autores del artículo incluyen al científico investigador del MIT Demian Park, el ex estudiante graduado del MIT Anthony Kulesa y el postdoctorado del MIT Eike-Christian Wamhoff. Paul Blainey, profesor asociado de ingeniería biológica y miembro del Instituto Broad, y Edward Boyden, profesor Y. Eva Tan en neurotecnología y profesor asociado de ingeniería biológica y de ciencias cerebrales y cognitivas, también son autores del estudio.
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Dr. Martin Passen, a dedicated nutrition educator with a master’s in nutrition education and nearing completion of a clinical nutrition and dietetics master’s. Passionate about sharing valuable information effectively.