En modelos de laboratorio y células derivadas de pacientes, una nueva versión de la técnica de edición de genes CRISPR-Cas9 corrige defectos de ARN detrás de una familia de enfermedades que incluye ciertos tipos de distrofia muscular, ELA y enfermedad de Huntington.
Estas son células musculares de un paciente con distrofia miotónica tipo I, no tratada (izquierda) y tratada con el sistema Cas9 dirigido a ARN (derecha). La proteína MBNL1 está en verde, el ARN repetitivo en rojo y el núcleo de la célula en azul. MBNL1 es una importante proteína de unión al ARN y su función normal se interrumpe cuando se une al ARN repetitivo. En las células tratadas de la derecha, se libera MBNL1 del ARN repetitivo.
Hasta hace poco, la técnica de edición de genes CRISPR-Cas9 solo podía usarse para manipular el ADN. En un estudio de 2016 , los investigadores de la Facultad de Medicina de la Universidad de California en San Diego reutilizaron la técnica para rastrear el ARN en células vivas en un método llamado Cas9 dirigido al ARN (RCas9). En un nuevo estudio, publicado el 10 de agosto en Cell , el equipo lleva RCas9 un paso más allá: utilizan la técnica para corregir errores moleculares que conducen a enfermedades de expansión de repetición de microsatélites, que incluyen distrofia miotónica tipos 1 y 2, la forma más común de enfermedad hereditaria. ELA y enfermedad de Huntington.
“Esto es emocionante porque no solo nos estamos enfocando en la causa raíz de enfermedades para las cuales no existen terapias actuales para retrasar la progresión, sino que hemos rediseñado el sistema CRISPR-Cas9 de una manera que es factible para administrarlo en tejidos específicos. a través de un vector viral”, dijo el autor principal Gene Yeo, PhD, profesor de medicina celular y molecular en la Facultad de Medicina de UC San Diego.
Mientras que el ADN es como el plano del arquitecto para una célula, el ARN es la interpretación del plano del ingeniero. En el dogma central de la vida, los genes codificados en el ADN del núcleo se transcriben en ARN y los ARN llevan el mensaje al citoplasma, donde se traducen para producir proteínas.
Las enfermedades de expansión de repeticiones de microsatélites surgen porque hay repeticiones errantes en secuencias de ARN que son tóxicas para la célula, en parte porque impiden la producción de proteínas cruciales. Estos ARN repetitivos se acumulan en el núcleo o citoplasma de las células, formando nudos densos, llamados focos.
En este estudio de prueba de concepto, el equipo de Yeo usó RCas9 para eliminar los ARN que causan problemas asociados con enfermedades de expansión repetida de microsatélites en células derivadas de pacientes y modelos celulares de las enfermedades en el laboratorio.
Normalmente, CRISPR-Cas9 funciona así: los investigadores diseñan un ARN “guía” para que coincida con la secuencia de un gen objetivo específico. El ARN dirige la enzima Cas9 al lugar deseado en el genoma, donde corta el ADN. La célula repara la ruptura del ADN de manera imprecisa, inactivando así el gen, o los investigadores reemplazan la sección adyacente al corte con una versión corregida del gen. RCas9 funciona de manera similar, pero el ARN guía dirige Cas9 a una molécula de ARN en lugar de ADN.
Los investigadores probaron el nuevo sistema RCas9 en ARN de enfermedades de expansión repetida de microsatélites en el laboratorio. RCas9 eliminó el 95 por ciento o más de los focos de ARN relacionados con la distrofia miotónica tipo 1 y tipo 2, un tipo de ELA y la enfermedad de Huntington. El enfoque también eliminó el 95 por ciento de los ARN repetidos aberrantes en células de pacientes con distrofia miotónica cultivadas en el laboratorio.
Otra medida del éxito se centró en MBNL1, una proteína que normalmente se une al ARN, pero que los focos de ARN en la distrofia miotónica tipo 1 secuestran cientos de sus objetivos naturales de ARN. Cuando los investigadores aplicaron RCas9, revirtieron el 93 por ciento de estos ARN disfuncionales. objetivos en las células musculares del paciente, y las células finalmente se parecían a las células de control sanas.
Si bien este estudio proporciona la evidencia inicial de que el enfoque funciona en el laboratorio, hay un largo camino por recorrer antes de que RCas9 pueda probarse en pacientes, explicó Yeo.
Un cuello de botella es la entrega eficiente de RCas9 a las células del paciente. Los virus adenoasociados no infecciosos se usan comúnmente en la terapia génica, pero son demasiado pequeños para retener a Cas9 en el ADN objetivo. El equipo de Yeo hizo una versión más pequeña de Cas9 eliminando regiones de la proteína que eran necesarias para la escisión del ADN, pero prescindibles para unir el ARN.
“Lo principal que aún no sabemos es si los vectores virales que entregan RCas9 a las células provocarían una respuesta inmune”, dijo. “Antes de que esto pudiera probarse en humanos, necesitaríamos probarlo en modelos animales, determinar las toxicidades potenciales y evaluar la exposición a largo plazo”.
Para hacer esto, Yeo y sus colegas lanzaron una empresa derivada llamada Locana para manejar los pasos preclínicos necesarios para trasladar RCas9 del laboratorio a la clínica para enfermedades basadas en el ARN, como las que surgen de las expansiones repetidas de microsatélites.
“Estamos realmente entusiasmados con este trabajo porque no solo definimos un nuevo mecanismo terapéutico potencial para CRISPR-Cas9, sino que demostramos cómo podría usarse para tratar una clase completa de afecciones para las que no existen opciones de tratamiento exitosas”, dijo David Nelles. , PhD, co-primer autor del estudio con Ranjan Batra, PhD, ambos investigadores postdoctorales en el laboratorio de Yeo.
“Hay más de 20 enfermedades genéticas causadas por expansiones de microsatélites en diferentes lugares del genoma”, dijo Batra. “Nuestra capacidad para programar el sistema RCas9 para apuntar a diferentes repeticiones, combinada con un bajo riesgo de efectos fuera del objetivo, es su principal fortaleza”.
Los coautores del estudio también incluyen: Elaine Pirie, Steven M. Blue, Ryan J. Marina, Harrison Wang, Isaac A. Chaim, Nigel Zhang, Vu Ngyuen, Stefan Aigner, Sebastian Markmiller, UC San Diego; James D. Thomas, Maurice S. Swanson, Guangbin Xia, Universidad de Florida; y Kevin D. Corbett, UC San Diego y Ludwig Cancer Research.
El equipo de investigación de UC San Diego fue financiado, en parte, por los Institutos Nacionales de Salud (HG004659, NS075449).
Divulgación: Gene Yeo y David Nelles son cofundadores de Locana y ocupan puestos de liderazgo en la empresa. Gene Yeo y Maurice Swanson forman parte del Consejo Asesor Científico de Locana. Gene Yeo también tiene una participación accionaria en Locana.
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