Borrar las ‘tijeras’ de CRISPR brinda una nueva visión de los trastornos autoinmunes

Cada una de nuestras células tiene los mismos 22.000 o más genes en su genoma, pero cada una usa diferentes combinaciones de esos mismos genes, encendiéndolos y desactivándolos según lo exija su función y situación. Son estos patrones de genes expresados ​​y reprimidos los que determinan en qué tipo de célula (riñón, cerebro, piel, corazón) se convertirá cada uno.

Para controlar estos patrones cambiantes, nuestros genomas contienen secuencias reguladoras que activan y desactivan los genes en respuesta a señales químicas específicas. Entre estos se encuentran los “potenciadores”, secuencias que pueden ubicarse a decenas de miles de letras genéticas de distancia de un gen, y aún así forzarlo a funcionar a toda marcha cuando se activan. Los pasos en falso en esta delicada coreografía pueden hacer que las células asuman el papel equivocado, causando enfermedades debilitantes, pero las regiones reguladoras involucradas son difíciles de encontrar y estudiar, ya que solo juegan un papel en células específicas, a menudo bajo condiciones muy específicas.

Ahora, un equipo de investigación dirigido por científicos de la Universidad de California ha utilizado una versión modificada de la técnica de edición de genes CRISPR para encontrar potenciadores, no editándolos sino incitándolos a actuar. Como se informó en línea el 30 de agosto de 2017, en  Nature , un equipo de UC San Francisco y UC Berkeley usó una herramienta llamada activación CRISPR (CRISPRa), desarrollada en UCSF en 2013, para buscar potenciadores de un gen que afecta el desarrollo del sistema inmunológico. células conocidas como células T. Las secuencias que encontraron iluminan los circuitos fundamentales de los trastornos autoinmunitarios, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y la enfermedad de Crohn.

El trabajo se llevó a cabo en los laboratorios de Alexander Marson, MD, PhD, profesor asistente de microbiología e inmunología en la UCSF, y Jacob Corn, PhD, profesor asistente adjunto de biología molecular y celular en Berkeley.

“Ahora no solo podemos encontrar estas regiones reguladoras, sino que podemos hacerlo tan rápida y fácilmente que es alucinante”, dijo Corn. “Habría tomado años encontrar solo uno antes, pero ahora una sola persona necesita solo unos meses para encontrar varios”.

Corn es cofundador y director científico del Innovative Genomics Institute (IGI), una iniciativa de Berkeley-UCSF de la que Marson es miembro afiliado. El IGI tiene como objetivo avanzar en la edición del genoma basada en CRISPR en medicina y agricultura para curar enfermedades humanas, acabar con el hambre y proteger el medio ambiente.

CRISPRa Activa Los Potenciadores

La llegada de CRISPR ha permitido a los investigadores avanzar rápidamente en la comprensión de los genes que codifican proteínas. En la aplicación más común de CRISPR, una enzima llamada Cas9 corta el ADN en secuencias particulares especificadas por la secuencia de un “ARN guía”. Usando la tecnología, los científicos pueden eliminar o editar cualquier gen y observar cómo estos cambios afectan las células o los organismos completos.

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Pero las secuencias que codifican directamente las proteínas constituyen solo el 2 por ciento de nuestro genoma. Los potenciadores y otros elementos reguladores del ADN repartidos por el otro 98 por ciento son más difíciles de estudiar, pero están implicados en una gran cantidad de trastornos genéticos. Los científicos pueden buscar secuencias de potenciadores potenciales en función de cómo interactúan con las proteínas que se unen al ADN, pero averiguar qué potenciadores funcionan con qué genes es mucho más difícil. Simplemente cortar un potenciador con CRISPR-Cas9 no ayuda, porque no tendrá un efecto perceptible si el potenciador está inactivo en el tipo de célula particular que se usa en un experimento.

Si piensas en el genoma como una casa modelo con 22 000 bombillas (los genes) y cientos de miles de interruptores (los potenciadores), los desafíos han sido encontrar todos los interruptores y averiguar qué bombillas controlan y cuándo. Anteriormente, CRISPR se ha utilizado para cortar cables en busca de aquellos que harían que una bombilla se apagara, dando una buena idea de lo que estaba haciendo esa sección del circuito. Sin embargo, apagar un interruptor de luz cuando está apagado no dice nada sobre lo que controla. Entonces, para encontrar ciertos interruptores de luz, ha sido común tratar de imitar las complicadas señales químicas que activan un potenciador.

Pero usando este método, “puede volverse loco rápidamente tratando de encontrar un potenciador”, dijo Benjamin Gowen, becario postdoctoral en el laboratorio de Corn en Berkeley y uno de los autores principales del estudio.

Un mejor enfoque sería un interruptor de “encendido” universal que pudiera apuntar a cualquier parte del genoma y, si esa parte incluyera un potenciador, podría activar ese potenciador. Afortunadamente, CRISPRa, desarrollado recientemente por Jonathan Weissman, PhD, profesor de farmacología celular y molecular en UCSF y codirector del IGI, es una de esas herramientas. CRISPRa utiliza una versión “reducida” de la proteína Cas9 que corta el ADN, atada a una cadena de proteínas activadoras. Aunque CRISPRa también usa ARN guía para apuntar a ubicaciones precisas en el genoma, en lugar de cortar el ADN, CRISPRa puede activar cualquier potenciador en el área.

Si bien las primeras aplicaciones de CRISPRa involucraron el uso de un solo ARN guía para encontrar promotores, secuencias justo al lado de los genes que ayudan a activarlos, el equipo de UCSF/Berkeley detrás del nuevo estudio se dio cuenta de que CRISPRa también podría ayudar a encontrar potenciadores. Al dirigir el complejo CRISPRa a miles de diferentes sitios potenciadores potenciales, razonaron, podrían determinar cuál tenía la capacidad de activar un gen en particular, incluso si ese gen estaba lejos del potenciador en el cromosoma.

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“Esta es una forma fundamentalmente diferente de ver las secuencias reguladoras no codificantes”, dijo Dimitre Simeonov, estudiante de doctorado en el laboratorio de Marson en la UCSF y otro autor principal del estudio.

Realización De 20.000 Experimentos A La Vez

El gen que el equipo eligió para estudiar produce una proteína llamada IL2RA, que es fundamental para la función de las células inmunitarias llamadas células T. Dependiendo de las condiciones del cuerpo, las células T tienen la capacidad de desencadenar la inflamación o suprimirla. El gen IL2RA produce una proteína que le dice a las células T que es hora de ponerse sus sombreros antiinflamatorios. Si los potenciadores que deberían activar el gen tienen errores, las células no logran suprimir la inflamación, lo que puede conducir a trastornos autoinmunes como la enfermedad de Crohn.

Para rastrear las ubicaciones de los potenciadores que controlan IL2RA, el equipo de UCSF y Berkeley produjo más de 20 000 ARN guía diferentes y los colocó en células T con una proteína Cas9 modificada.

“Básicamente realizamos 20.000 experimentos en paralelo para encontrar todas las secuencias que activan este gen”, dijo Marson.

Efectivamente, apuntar a algunas de las secuencias con CRISPRa aumentó la producción de IL2RA, lo que generó una breve lista de ubicaciones que podrían ser importantes para regular el destino de las células T.

“Cada vez que tienes la oportunidad de hacer una pregunta de una manera totalmente nueva, de repente puedes descubrir cosas que te habrías perdido con los métodos más antiguos”, dijo Gowen. “Encontramos estos potenciadores sin tener que hacer ninguna suposición de cómo se veían”.

Vinculación De Potenciadores Mutantes Con Enfermedades Inflamatorias

Una de las posibles secuencias potenciadoras que identificó el equipo incluía el sitio de una variante genética común que ya se sabía que aumentaba el riesgo de EII, aunque no se entendía cómo lo hacía. Los equipos de Marson y Corn se preguntaron si esta variación genética podría alterar el interruptor que regula la cantidad de proteína IL2RA presente en las células T. Para probar esto, modificaron las células T de ratón para que contuvieran la variante genética asociada con la enfermedad humana y descubrieron que estas células T producían menos IL2RA.

“Esto comienza a desbloquear el circuito fundamental de la regulación de las células inmunitarias, lo que aumentará drásticamente nuestra comprensión de la enfermedad”, dijo Marson.

A continuación, el equipo espera expandir el método, tal vez encontrando formas de buscar potenciadores de muchos genes diferentes a la vez, haciendo que la búsqueda de reguladores de los trastornos inmunológicos sea mucho más rápida. Y esperan que el método sea una herramienta ampliamente aplicable para desvincular las interacciones genéticas en todo tipo de células.

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“Creemos que este será un método muy útil en general”, dijo Corn. “Sería fácil para alguien interesado en las neuronas o cualquier otro tipo de célula tomarlo y buscar los potenciadores involucrados en la programación del comportamiento de esas células”.

Otros autores incluyen a Theodore L. Roth, Youjin Lee, John D. Gagnon, Alice Y. Chan, Dmytro S. Lituiev, Michelle L. Nguyen, Rachel E. Gate, Eric Boyer, Frederic Van Gool, Meena Subramaniam, Zhongmei Lee, Jonathan M. Woo, Victoria R. Tobin, Kathryn Schumann, K. Mark Ansel, Chun Ye, William J. Greenleaf, Mark S. Anderson y Jeffrey A. Bluestone de UCSF; Mandy Boontanrart, Nicholas L. Bray, Therese Mitros, Graham J. Ray, Gemma L. Curie, Nicki Naddaf, Julia S. Chu y Hong Ma de Berkeley; Maxwell R. Mumbach, Howard Y. Chang y Ansuman T. Satpathy de la Universidad de Stanford; Hailiang Huang, Ruize Liu y Mark J. Daly de la Universidad de Harvard; y Kyle K. Farh de Illumina Inc.

Esta investigación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud (becas DP3DK111914-01, R01HG0081410-01, R01HL109102, P50-HG007735, S10RR029668, S10RR027303 y P30 DK063720), la Fundación de Investigación de Esclerodermia, la Beca Sandler de UCSF, un regalo de Jake Aronov , una subvención de la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple (CA 1074-A-21) y el Programa Marcus en Innovación en Medicina de Precisión. Marson y Schumann han presentado una patente sobre el uso de proteínas ribonucleares Cas9 para editar el genoma de células hematopoyéticas primarias humanas. Chang y Greenleaf son cofundadores de Epinomics. Marson se desempeña como asesor de Juno Therapeutics y PACT Therapeutics, y el laboratorio de Marson ha recibido apoyo de investigación patrocinado por Juno Therapeutics and Epinomics.

UC San Francisco (UCSF) es una universidad líder dedicada a promover la salud en todo el mundo a través de la investigación biomédica avanzada, la educación de posgrado en ciencias biológicas y profesiones de la salud, y la excelencia en la atención al paciente. Incluye las mejores escuelas de posgrado en odontología, medicina, enfermería y farmacia; una división de posgrado con programas de renombre nacional en ciencias básicas, biomédicas, traslacionales y de población; y una empresa preeminente de investigación biomédica. También incluye UCSF Health, que comprende tres hospitales de primer nivel,  UCSF Medical Center  y UCSF Benioff Children’s Hospitals en  San Francisco  y  Oakland , y otros hospitales asociados y afiliados y proveedores de atención médica en toda el Área de la Bahía.

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